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≪ 　Bio-Rad「DCプロテインアッセイキット�U」のプレートリーダーを用いた測定方法　 ≫

1.準備 Bio-Rad社製「DCプロテインアッセイキット�U 　　(A試薬250ml×1、B試薬1l×2、S試薬5ml×1、スタンダード�U×1) 　　※スタンダード�Uのみ4℃環境下で保存。その他の試薬は常温。 プレートリーダー(SH-1300) マイクロプレート(greiner 透明96穴プレート) 分注器(5μl、25μl、200μlが分注できるピペット) プレートミキサー(BioTec) 2．分注量・分注ポジション 1ウェル 96ウェル スタンダード 5µl 480µl A'試薬 25µl 2400µl B試薬 200µl 1920µl 計 230µl 4800µl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 精製水 B 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 90.6 C 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 181.3 D 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 362.5 E 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 483.3 F 725 725 725 725 725 725 725 725 725 725 725 725 G 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 966.7 H 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 1450 3.試薬準備・測定手順 凍結乾燥状態のスタンダード�Uに精製水を20ml入れて溶解する。 溶解したスタンダード(原液とする)から希釈系列を作成する。下記の表を参照のこと。 A試薬とS試薬を規定比で混合させ、A'試薬を調製する。下記の表を参照のこと。 マイクロプレートにスタンダードを5μlずつ分注する。 スタンダードを分注したウェルにA'試薬を25μlずつ分注する。 プレートミキサーを用いてプレートを1分間攪拌する。 スタンダードA'試薬を分注したウェルにB試薬を200μlずつ分注する。 プレートミキサーを用いてプレートを1分間攪拌する。 室温で15分間インキュベートする。 プレートリーダーにプレートをセットし、750nmで測定する。 結果より検量線を作成する。 スタンダード希釈系列の作成 濃度 スタンダード 液量 精製水 計 1 1450µl/ml 凍結乾燥品 1ビン 20ml 20ml 2 966.7µl/ml 1450µl/ml 150µl 100µl 250µl 3 725µl/ml 1450µl/ml 200µl 200µl 400µl 4 483.3µl/ml 725µl/ml 150µl 100µl 250µl 5 362.5µl/ml 725µl/ml 100µl 100µl 200µl 6 181.3µl/ml 362.5µl/ml 100µl 100µl 200µl 7 90.6µl/ml 181.3µl/ml 100µl 100µl 200µl A'試薬作成時の混合比 A試薬 1000 2000 3000 4000 5000 S試薬 20 40 60 80 100 計(A'試薬) 1020 2040 3060 4080 5100            : 本検証 4.準備 測定方式 吸光度 測定法 エンドポイント 波長 750nm プレート SBS規格 96ウェル フラッシュ回数 10回 ミキシング OFF 測定方向 →← プレート移動スピード 標準 5.測定結果 SH-1300で測定 試料濃度 (μg/ml) 平均 (Abs) A 0 0.079 B 90.6 0.098 C 181.3 0.124 D 362.5 0.175 E 483.3 0.194 F 725 0.260 G 966.7 0.300 H 1450 0.418

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