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| ■ヒトP450 の分子種のひとつである CYP3A4 に対する阻害の検討 |
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内 容
阻害剤としてケトコナゾールを用いた場合の CYP3A4 における IC 50 を求めた。 |
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測定手順
1. 試薬 |
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| 基質 | ：BFC (7-Benzyloxy-4-(trifluoromethyl)-coumarin) ：終濃度50μM |
| 阻害剤 | ：Kotoconazole (終濃度5μMから0.00229μMまで1/3ずつ希釈) |
| 発現系P450 | ：ヒトCYP3A4 (日本農産工業(株)ご提供) ：1 pmol/well |
| NADPH生成系 | ：終濃度3.3mM G-6-P, 3.3mM MgCl 2・6H 2 O, 1.3mM NADP, 0.4U/ml G-6-PDH |
| 緩衝液 | ：200mM K-PO4 , 0.1mM EDTA (pH7.4) |
| 代謝物 | ：HFC (7-Hydroxy-4-(trifluoromethyl)-coumarin) |
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実験手順
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| 1. | アセトニトリルに溶解した所定濃度のHFCを含むNADPH生成系含有リン酸緩衝液をA1およびB1ウェルに150μずつl分注する。 |
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| 2. | アセトニトリルに溶解した所定濃度のBFCを含むNADPH生成系含有リン酸緩衝液をC1, D1, E1の各ウェルに150μlずつ分注する。 |
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| 3. | アセトニトリルを所定濃度含むNADPH生成系含有リン酸緩衝液をA2〜A10, B2〜B10, C2〜C10, D2〜D10, E2〜E10の各ウェルに100μlずつ分注する。 |
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| 4. | 振とうしながら第1列から50μl分取し第2列に加える。ピペッティングにより十分攪拌後、第2列から50μl分取し第3列に加える。このようにして第8列まで1/3ずつの希釈系列を作成する。第8列から分取した50μｌは廃棄する。 |
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| 5. | 振とうしながら37℃、10分間プレインキュベーションする。 |
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| 6. | 所定濃度のCYP3A4を100μlずつ第1列から第9列まで加える。 |
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| 7. | 振とうしながら37℃、30分間インキュベートする。 |
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| 8. | 30分経過後、反応停止液のアセトニトリルを75μlずつ全ウェルに添加する。 |
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| 9. | 振とうしながら所定濃度のCYP３A4を100μlずつ第10列の各ウェルに加える。 |
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※本手順の操作は日立工機(株)製AP2形マイクロプレートシステムを使用して行った。また詳細手順は、下記を参照のこと。
http://www.bdbioscience.com/discovery_labware/gentest/products/HTS_KITS/HTS/hts_assay_proc.shtml |
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